Выбор антибактериальных аптамеров против белка BamA у Pseudomonas aeruginosa путем использования генетического алгоритма для оптимизации метода компьютерного скрининга

Научные отчеты, том 13, Номер статьи: 7582 (2023) Цитировать эту статью

607 Доступов

2 Альтметрика

Подробности о метриках

Устойчивость к антибиотикам является одной из крупнейших угроз глобальному здравоохранению, приводящей к увеличению числа людей, страдающих от тяжелых заболеваний или умирающих из-за инфекций, которые когда-то легко излечились с помощью антибиотиков. Pseudomonas aeruginosa является основным патогеном, у которого быстро развилась устойчивость к антибиотикам, и ВОЗ отнесла этот патоген к критическому списку. ДНК-аптамеры могут выступать в качестве потенциальных кандидатов на роль новых противомикробных агентов. В этом исследовании мы продемонстрировали, что существующий аптамер способен влиять на рост P. aeruginosa. Был проведен компьютерный скрининг аптамеров, которые могли бы связываться с хорошо консервативным и важным белком внешней мембраны BamA у грамотрицательных бактерий. Молекулярный докинг около 100 функциональных аптамеров ДНК с белком BamA был выполнен с использованием как локального, так и глобального подхода докинга. Кроме того, был проведен анализ генетических алгоритмов для ранжирования аптамеров на основе их аффинности связывания. Для исследования их антибактериальной активности in vitro были синтезированы лучшие аптамеры с хорошим связыванием с белком BamA. Среди всех аптамеров Apt31, который, как известно, связывается с противоопухолевым средством дауномицином, продемонстрировал самый высокий показатель по шкале HADDOCK и привел к значительному (p <0,05) снижению роста P. aeruginosa. Apt31 также вызывал разрушение мембраны, что приводило к утечке ДНК. Следовательно, компьютерный скрининг может привести к идентификации аптамеров, которые связываются с желаемым активным сайтом с высоким сродством.

Pseudomonas aeruginosa — это грамотрицательная условно-патогенная бактерия, вызывающая многие нозокомиальные инфекции и являющаяся основным возбудителем муковисцидоза легких инфицированных пациентов. Кроме того, он также связан с другими внутрибольничными инфекциями, такими как вентилятор-ассоциированная пневмония, инфекция, связанная с мочевым катетером, хирургическая/трансплантационная инфекция и многие другие1. Недавно также было обнаружено, что P. aeruginosa является вторым наиболее часто выявляемым возбудителем у пациентов с COVID-19, вызывающим коинфекцию2,3,4. Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) классифицировала этот смертельный организм как патоген ESKAPE, а также отнес его к Приоритету 1: Критический список из-за появления штаммов с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ). Инфекции, вызванные P. aeruginosa, становится все труднее и почти невозможно лечить, поскольку у некоторых штаммов развилась устойчивость почти ко всем доступным в настоящее время антибиотикам, даже к лечению в крайнем случае, тем самым увеличивая уровень заболеваемости и смертности во всем мире5. Поэтому существует острая необходимость в поиске новых противомикробных препаратов для преодоления этого глобального кризиса в области здравоохранения.

Производство антибиотиков является дорогостоящим и трудоемким: для того, чтобы антибиотик попал на рынок, требуется почти 10 лет, но бактериям может потребоваться уже 11 дней, чтобы выработать устойчивость к нему6. Следовательно, следует рассмотреть альтернативный подход для предотвращения глобальной бедности, вызванной устойчивостью к противомикробным препаратам (УПП). Перепрофилирование лекарств, также известное как перепозиционирование лекарств или перепрофилирование лекарств, в последнее время привлекло огромное внимание в фармацевтической промышленности, поскольку открытие новых терапевтических показаний для уже существующих лекарств может сократить сроки и стоимость разработки лекарств. Безопасность и токсичность перепрофилированных лекарств также хорошо изучены, и поэтому их можно считать безопасными для нового терапевтического использования. Следовательно, перепрофилирование аптамеров может снизить стоимость и продолжительность открытия новых аптамеров и разработки лекарств. Аптамеры стали многообещающими инструментами диагностики и терапии в области микробиологии. Аптамеры представляют собой свернутые короткие одноцепочечные олигонуклеотиды (ДНК/РНК), которые могут специфически связываться и образовывать комплексы с молекулярными мишенями, такими как белки7. Это связывание может вызывать терапевтические эффекты, и многие терапевтические аптамеры уже проходят клинические испытания. Например, Макуген — аптамер, одобренный FDA и доступный на рынке в качестве препарата для лечения дегенерации желтого пятна7. Аптамеры являются потенциальными антимикробными агентами, поскольку они экономически эффективны и, что наиболее важно, обладают различными преимуществами перед антителами и антибиотиками, такими как низкая иммуногенность, короткие сроки производства и высокая стабильность8. Аптамеры также допускают структурные и химические модификации, что в конечном итоге расширяет их клиническое применение8. Кроме того, идентификация подходящих мишеней для связывания аптамеров у бактерий также важна, поскольку низкая проницаемость внешнего слоя мембраны грамотрицательных бактерий является одной из основных причин развития УПП9. Таким образом, выбранная мишень должна быть легко доступна без необходимости проходить через низкопроницаемый слой внешней мембраны P. aeruginosa, и, следовательно, белки внешней мембраны могут быть потенциальными мишенями.

90% of the residues fell under the most favoured region. Besides, the Ramachandran plot (Supplementary Fig. 2) also predicted that the model consisted mostly of β-sheets with small segments of α-helix which corresponded to the secondary structures BamA and other outer membrane proteins. The final Pseudomonas BamA structure with a lateral gate is shown in Fig. 1C. Darobactin was docked with Pseudomonas BamA to determine its binding site. The experimental PDB structure of E. coli (7P1C) and modelled Pseudomonas BamA bound to Darobactin were shown for comparison in Fig. 1D. The similar binding site in both experimental and modelled structures further validates the Pseudomonas BamA model./p> 0.05) as Apt31, as these aptamer candidates exhibited higher HADDOCK scores and they were binding distant from the lateral gate in global docking. The measured DNA concentration for the DNA leakage assay was solely dependent on the DNA released by the bacteria cells as purification of the supernatant completely removed the aptamers (Supplementary Fig. 3). In addition to growth inhibition, the concentration of DNA released was also higher for the Apt31 treated group compared to Apt33, HTO008 and the control group (Fig. 4D). This suggests that the Apt31 treatment resulted in compromised membrane integrity in P. aeruginosa cells./p> 0.05) effect on P. aeruginosa growth and survival as well as in DNA leakage compared to PBS control. Although Apt33 ranked first in the GA analysis, it did not show any significant (p > 0.05) effect on bacterial growth. This may be due to its binding site which was further away from the lateral gate region in the global docking analysis. The GA ranking was based on HADDOCK 2.4 output which uses a local docking approach where the binding site in BamA needs to be specified. Under natural conditions, the Apt33 might bind further away from the lateral gate as implied by the global docking which may not inhibit BamA activity. Moreover, the Gibbs Free Energy for Apt33 is also high which indicates that the folding is unfavourable and the structure has low stability. This may also account for the insignificant effect of Apt33 on P. aeruginosa growth. In future, both local and global docking approaches should be analysed concurrently to obtain reliable and specific drug binding. Besides, more advanced machine learning techniques coupled with global and local docking analysis can reveal the best binding aptamers to the lateral gate region in BamA. The antibacterial effect of Apt31 can be further enhanced by making some chemical modifications to the aptamer to increase its binding affinity and stability. The binding of Apt31 to BamA in P. aeruginosa with high affinity can be challenging due to the repulsion between the negatively charged aptamer and the negatively charged outer membrane39. In addition, nucleases produced by bacteria can also degrade the aptamer, thereby decreasing its antibacterial activity. Hence, modifying the aptamers such as replacing the phosphodiester linkage of DNA with methylphosphonate will reduce the overall negative charge of the aptamers and facilitate the binding of aptamers to the outer membrane protein40. Modification to the sugar ring of nucleoside such as 2′-O-methyl-substitution in the aptamer can also resist nuclease degradation and increase the thermostability40./p>